ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA TERPENOID YANG AKTIF ANTIBAKTERI PADA HERBA MENIRAN (Phyllanthus niruri Linn)

Telah dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa terpenoid antibakteri dari herba meniran (Pyllanthus niruri Linn) dengan metode Kromatografi Gas – Spektroskopi Massa. Ekstraksi senyawa dilakukan dengan dua cara yaitu maserasi dengan pelarut metanol dan sokletasi dengan pelarut n–heksanaa.

Hasil uji fitokimia menggunakan pereaksi Lieberman-Burchard pada ekstrak n–heksanaa hasil maserasi dan ekstrak n–heksanaa hasil sokletasi menunjukkan bahwa kedua ekstrak tersebut positif mengandung senyawa terpenoid.   Hasil   uji   aktivitas   ekstrak   n–heksanaa  terhadap   bakteri   Escherichia   coli   ATCC®    25292   dan Staphylococcus aureus ATCC® 25293 menunjukkan fraksi n–heksanaa hasil sokletasi memberikan daya hambat yang lebih baik. Daya hambat fraksi n–heksanaa hasil maserasi adalah 1 mm terhadap bakteri Escherichia coli dan 0,5 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus, sedangkan daya hambat fraksi n–heksanaa hasil sokletasi yaitu 10 mm terhadap bakteri Escherichia coli dan 12 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus.


Ekstrak n–heksanaa hasil sokletasi dimurnikan dengan menggunakan kromatografi kolom dan diidentifikasi dengan Kromatografi Gas – Spektroskopi Massa. Data Kromatografi Gas – Spektroskopi Massa, menunjukkan kemungkinan ekstrak n–heksanaa hasil sokletasi mengandung dua buah senyawa yaitu phytadiene [M+] 278 dan senyawa 1,2-seco-cladiellan m/z 335 [M+- H].


Ekstraksi senyawa terpenoid dilakukan
dengan dua cara yaitu : 
1. Sokletasi  
Seberat 1000 g serbuk kering herba meniran disokletasi dengan 5 L pelarut n –heksana. Ekstrak n-heksana dipekatkan lalu disabunkan dalam 50 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksana dikentalkan lalu diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri. 

2. Maserasi 
Seberat 1000 g serbuk kering herba  meniran dimaserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol dipekatkan lalu dihidrolisis dalam 100 mL HCl 4 M. Hasil hidrolisis diekstraksi dengan    5 x 50 mL n – heksana. Ekstrak n-heksana dipekatkan lalu disabunkan dalam 10 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksana dikentalkan lalu diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri.   


Uji aktivitas antibakteri  
Ekstrak n-heksanaa diuji aktivitasnya terhadap bakteri Eschericia coli dan  Staphyloccocus aureus dengan tahap – tahap sebagai berikut :  

1. Diambil sebanyak satu koloni biakan bakteri Eschericia coli dengan menggunkan jarum ose yang dilakukan secara aseptis. 
2. Dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 2 mL Mueller-Hinton broth kemudian diinkubasi selama 24 jam  pada suhu 35ºC .  
3. Suspensi bakteri homogen yang telah diinkubasi siap dioleskan pada permukaan media Mueller-Hinton agar, secara merata dengan menggunakan lidi kapas yang steril.  
4. Kemudian ditempelkan disk yang berisi sampel, standar tetrasiklin serta pelarutnya (n-heksana) yang digunakan sebagai kontrol. 
5. Lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu  35ºC .  
6. Dilakukan pengukuran daya hambat zat terhadap bakteri.  
7. Untuk biakan bakteri Staphyloccocus aureus dilakukan dengan cara yang sama seperti biakan bakteri  Eschericia coli, namun suhunya berbeda yaitu pada suhu 37ºC

Ekstrak yang positif terpenoid dan paling aktif  antibakteri dipisahkan mengunakan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel 60 dan fase gerak kloroform : metanol (3 : 7). Fraksi-fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri. Fraksi yang positif terpenoid dan paling aktif antibakteri dilanjutkan ke tahap pemurnian menggunakan kromatograi lapis tipis. 


Isolat yang relatif murni selanjutnya diidentifikasi menggunakan kromatogafi gas – spektroskopi massa. 

 Kromatogram gas fraksi n-heksana positif terpenoid dan aktif antibakteri ditampilkan pada Gambar diatas yang menunjukkan terdapatnya dua buah puncak dengan waktu retensi berturut-turut : 25,74 dan 21,93 menit. Berdasarkan data di atas senyawa tersebut mengandung dua buah senyawa.  

PENENTUAN STRUKTUR

Spektrum massa senyawa puncak I (A) dan spektrum massa phytol (B) 

Spektrum massa senyawa puncak I  ditampilkan pada Gambar diatas. Berdasarkan data spektrum, senyawa pada puncak I mempunyai berat molekul m/z 278. Berdasarkan data base kromatografi gas - spektroskopi massa ditampilkan senyawa yang memiliki kemiripan 83% dengan senyawa pada puncak I. Senyawa tersebut adalah phytol dengan berat molekul m/z 296[M +], spektrum massanya ditampilkan pada Gambar 2 dan strukturnya ditampilkan pada Gambar 3. Phytol dapat mengalami dehidrasi secara alami menjadi phytadiene pada kelompok B dari Botryococcus braunii dimana Botryococcus braunii merupakan salah satu spesies dari alga hijau (Zang dan Sach, 2006; Fukushima et al., 1992; Grossi et al., 1996). Data pektroskopi massa dari phytadiene yaitu m/z 278[M+], 263, 179, 123, 109, 95, 82, 68, 57 (Nguyen et al., 2002). Spektrum massa phytadiene menyerupai spektrum massa senyawa puncak I m/z 278[M + A  B  ]. Pada spektrum massadodekane terdapat puncak dasar m/z 57 yang diapit oleh puncak tinggi lainnya yaitu puncak m/z 43 dan m/z 71 (Baker, 2000) yang merupakan puncak khas dodekane. Pada spektrum massa puncak I terdapat puncak m/z 71 sebagai puncak dasar dan muncul pula puncak khas lainnya dari dodekane yaitu puncak m/z 43 dan m/z 57 dengan  kelimpahan yang cukup tinggi. Hal ini berarti senyawa puncak mempunyai gugus seperti dodekane. Dodekane memiliki 20 atom C dan adanya ikatan rangkap           (Baker, 2000), hal ini juga terlihat pada struktur phytadiene yang tersusun atas 20 atom C dan dua buah ikatan rangkap yang ditampilkan pada gambar 4. Setelah difragmentasi, struktur phytadiene mengikuti pola fragmentasi senyawa pada puncak I. Pola fragmentasi senyawa phytadiene ditampilkan pada Tabel 4 dan Gambar 5. Dengan demikian senyawa pada puncak I m/z 278 diduga sebagai senyawa phytadiene berdasarkan data Spektroskopi Massa, pola fragmentasi dan  hubungan antara senyawa puncak I dengan phytol, phytadiene dan dodekane. 

Identifikasi Senyawa Pada Puncak II tr 21,93 menit

Spektrum Massa senyawa puncak II

Spektrum senyawa pada puncak II ditampilkan pada gambar 6. Dari data spektrum,senyawa puncak II memiliki berat molekul m/z 335. Berdasarkan hasil penelusuran internet, terdapat beberapa buah senyawa dengan m/z 335 diantaranya DL-Leucyl-glycyl-DLphenylalanine, 4-metoksi-4-metil-1-(4-nitrophenyl)-decane-1,3-dione, 2-{1-[2-(3,4dimethoxyanilino)-2-oxoethyl}cyclohexyl}acetic acid, 2-(acetylamino)-3-{3(cyclopentylmethoxy)-2methoxyphenyl}propanoic acid. Senyawa-senyawa tersebut memang memiliki berat molekul m/z 335 sesuai dengan m/z senyawa pada puncak II tetapi pola fragmentasi senyawa–senyawa tersebut tidak memenuhi pola fragmentasi senyawa pada puncak II. Oleh karena itu ditelusuri senyawa yang memiliki berat molekul  m/z 336 yang memiliki pola fragmentasi yang memenuhi pola fragmentasi senyawa puncak II dengan asumsi bahwa senyawa dengan berat molekul m/z 336 adalah senyawa yang memiliki berat molekul m/z 335 [M + - H].

Berdasarkan data hasil penelusuran  internet, terdapat struktur senyawa yang memiliki berat molekul m/z 336 dengan gugus dan pola fragmentasi yang memenuhi gugus dan pola fragmentasi senyawa pada puncak II. Senyawa tersebut adalah 1,2-seco-cladiellan (Friedal et al., 2005), strukturnya ditampilkan pada gambar 7.  Senyawa 1,2-seco-cladiellan terbentuk dari karvon (Friedal et al., 2005) dimana karbon merupakan senyawa golongan monoterpenoid yang mengandung gugus keton (Ikan, 1976). Terdapatnya gugus keton pada sebuah spektrum massa suatu senyawa terlihat pada puncak m/z 55 dan adanya pemecahan yang terjadi pada ikatan C – C  sebelah atom oksigen (Silverstain et al., 1986). Pada senyawa puncak II terlihat adanya puncak m/z 55 dan pemecahan ikatan C – C sebelah atom oksigen dapat terlihat pada m/z 292 (M+- H - 43) yang kehilanganmolekul C3H7.

Berdasarkan data di atas ditarik suatu kesimpulan yaitu senyawa puncak II diduga sebagai senyawa 1,2–seco–cladiellan, karena struktur senyawa ini memenuhi pola fragmentasi senyawa puncak II.  

KESIMPULAN

Herba meniran (Phyllanthus niruri Linn)  mengandung dua senyawa terpenoid yang diduga jenis phytadiene dan 1,2-seco cladiellan, di mana campuran kedua senyawa ini aktif terhadap bakteri Escherichia coli ATCC ® 25292 dan bakteri Staphylococcus aureus ATCC®  25293

SUMBER: ejournal.unud.ac.id/abstrak/j-kim-vol2-no1-gunawan.pdf