Flavonoid antioksidan penangkap radikal dari daun kepel (Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook f. & Th.)

Flavonoid antioksidan penangkap radikal dari daun kepel 

(Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook f. & Th.)

Antioxidant–free radical scavenging of flavonoid from The
Leaves of Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook f. & Th.

Titik Sunarni 1*), Suwidjiyo Pramono ²) dan Ratna Asmah ²)
1) Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi, Surakarta
2) Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Abstrak

Telah dilakukan uji aktivitas antioksidan penangkap radikal terhadap isolat flavonoid dari daun kepel (Stelechocarpus burahol). Ekstrak air daun dipekatkan kemudian disuspensikan dalam etanol untuk mendapatkan fraksi etanolik.   Selanjutnya  dilakukan   kromatografi  kertas   berulang   hingga diperoleh  isolat  murni  secara  kromatografi.  Semua  isolat  diidentifikasi dengan kromatografi kertas, kecuali isolat B4b dilanjutkan identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis, FT-IR and ¹H-NMR. Uji aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode penangkapan radikal DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl).
Semua isolat flavonoid menunjukkan aktivitas antioksidan penangkap radikal DPPH. Isolat B4b  mempunyai aktivitas paling kuat dengan nilai  EC50
6.43 µg/mL. Hasil identifikasi menunjukkan isolat B4b sebagai flavon dengan gugus hidroksi pada C-3, C-7, C-3', C-4' and metil pada C-5.
Kata kunci : Stelechocarpus burahol, flavonoid, antioksidan, DPPH

Abstract

The activity testing of flavonoid compounds as antioxidant and as scavenger of free radical, isolated from the Stelechocarpus burahol leaves had been performed. The aqueous extract of the leaves was concentrated and then suspended in ethanol to produce ethanolic fraction. The fraction was chromatographed on several paper chromatography systems to produce isolate with chromatographic purity.The all isolated flavonoid was identified by paper chromatography system. Especially, the B4b isolate were identified further using spectrometer UV-Vis, FT-IR and ¹H-NMR. Their antioxidant activities  were  done  by  the  DPPH  (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical scavenging method.
The all isolated flavonoid showed activity as DPPH scavenger. Among these isolate, B4b exhibited a strong free radical scavenging  with an EC50   value  of  6.43  µg/mL.  They  were  identified  and  B4b   isolate  was pressumed as flavon with hydroxyl group on C-3, C-7, C-3', C-4' and methyl on C-5.
Key words :  Stelechocarpus burahol, flavonoid, antioxidant, DPPH


Pendahuluan
Perkembangan pengetahuan menunjuk- kan hubungan antara kimiawi radikal dengan keterlibatannya pada proses biologi normal ataupun pada beberapa penyakit yang

dihubungkan dengan ketuaan. Stres oksidatif, yang  diinduksi  oleh  radikal,  diketahui  sebagai salah satu faktor penyebab penyakit degeneratif.
Antioksidan   merupakan   senyawa   yang mampu   menghambat   oksidasi   molekul   lain

Tubuh tidak mempunyai sistem pertahanan antioksidatif   yang   berlebihan,   sehingga   jika terjadi paparan radikal berlebih tubuh membutuhkan antioksidan eksogen. Kekhawa- tiran terhadap efek samping antioksidan sintetik (Rohdiana,  2001)  maka  antioksidan  alami menjadi  alternatif yang  terpilih.
Antioksidan alami mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan yang disebabkan spesies oksigen reaktif, mampu menghambat penyakit degeneratif serta mampu menghambat peroksidasi    lipid   pada   makanan.   Beberapa tahun terkhir terjadi peningkatan minat untuk mendapatkan antioksidan alami. Studi menunjukkan senyawa fenolik seperti flavonoid mempunyai aktivitas antioksidan penangkap radikal (Cos et al.., 2001; Gulcin et al., 2004).
Stelechocarpus burahol  atau dikenal dengan nama kepel secara tradisionaldigunakan sebagai obat  untuk  menurunkan  kadar  asam urat dan diuretik. Sutomo (2003) melaporkan fraksi tidak larut petroleum eter dari ekstrak metanol daun kepel mampu menurunkan kadar asam urat dan hasil identifikasi menunjukkan adanya   flavonoid.  Menurut   Cos et al., (1998) aktivitas flavonoid sebagai penurun kadar asam urat  melalui  penghambatan  enzim  xantin oksidase dari beberapa flavonoid selain dapat menghambat enzim xantin oksidase juga bersifat   sebagai antioksidan penangkap radikal superoksida.
Sebagai  upaya pencarian  antioksidan alami, maka telah dilakukan penelitian kandungan flavonoid antioksidan penangkap radikal  dari  daun  kepel.  Potensi antioksidan penangkap radikal ditentukan menggunakan DPPH,  suatu  radikal  stabil  dalam  larutan  air atau metanol dan mampu menerima sebuah elektron atau radikal hidrogen untuk menjadi molekul  diamagnetik  yang  stabil  (Oke  et  al.,
2002; Hou et al., 2002). DPPH pada uji ini ditangkap oleh antioksidan yang melepaskan hidrogen, sehingga membentuk DPPH-H tereduksi. Warna berubah dari violet menjadi kuning dan diikuti penurunan serapan pada panjang gelombang 517 nm. Adanya penurunan serapan tersebut  maka  aktivitas  antioksidan penangkap radikal dapat diketahui.

Metodologi Bahan
Daun kepel diambil dari Desa Karangbangun
Matesih Karanganyar saat tanaman berbunga pada
bulan Agustus 2004. Determinasi dilakukan oleh Laboratorium Morfologi & Sistematika Tumbuhan Universitas Setia Budi. Pelarut organik dan bahan pereaksi yang digunakan berderajat pro analisis.

Pembuatan fraksi etanolik
Serbuk  daun  kering  120  g  direbus  dalam panci infus dengan 1,32 L air selama 15 menit pada suhu 90°C kemudian disaring panas. Sari diuapkan di atas penangas air sampai kental kemudian ditambah etanol absolut sampai terjadi padatan kembali. Filtrat disaring dan dipekatkan dengan penguap vakum, selanjutnya disebut fraksi etanolik.

Isolasi flavonoid antioksidan penangkap radikal
Sebanyak 9 g fraksi etanolik dilarutkan dalam metanol  dan  ditotolkan  pada  kertas  kromatografi Toyo no.51 membentuk garis. Kertas dikembangkan dengan fase gerak air kemudian dilanjutkan asam asetat 10%. Diperoleh dua  bercak positif dengan uap amonia dan DPPH, yaitu   bercak A dan B. Bagian kertas yang mengandung bercak A dan B dipotong membentuk pita-pita kertas. Masing- masing potongan direndam dalam metanol sambil digojok semalam kemudian disaring dengan kertas Whatman no 42. Filtrat diuapkan dan disimpan dalam eksikator hingga kering, diperoleh fraksi A (150 mg) dan fraksi B (180 mg).

Fraksi A di kromatografi pada kertas Toyo no. 51 menggunakan fase gerak jenuh air dari toluena-n-butanol-asam  asetat  diperoleh  isolat  A1 (80 mg). Kromatografi isolat B menggunakan fase gerak  n-butanol-asam asetat-air (3:1:1)  dengan  dua kali pengembangan diperoleh bercak B2, B3, dan B4. Hasil perendaman bercak B2 di kromatografi menggunakan silika gel GF254 menggunakan fase gerak jenuh air dari   toluena-n-butanol-asam asetat dan diperoleh isolat B2  (30 mg). Filtrat hasil perendaman   bercak   B3    dilakukan   kromatografi kertas  fase  gerak  n-butanol-asam asetat-air  (3:1:1) diperoleh  isolat  B3   (8  mg).  Bercak  B4   direndam dalam metanol–air (4:6) dan filtrat direfluk dengan asam klorida 2N 60 menit. Filtrat hasil refluk dipartisikan   dengan 150 mL eter sebanyak 3 kali. Bagian eter   diuapkan dan di kromatografi kertas dengan n-butanol-asam asetat-air (3:1:1). Kromato- gram yang diperoleh menunjukkan dua bercak, B4a dan B4b.  Potongan pita kedua bercak tersebut direndam dalam metanol dan selanjutnya filtrat diuapkan  hingga  kering  dan  diperoleh  isolat  B4a (10 mg) dan B4b (17 mg).


Penentuan golongan flavonoid
Kromatografi kertas digunakan untuk penentuan golongan flavonoid dari fraksi dan isolat yang diperoleh. Deteksi bercak dilakukan dibawah sinar UV366 dengan pendeteksi uap ammonia dan sitroborat. Deteksi aktivitas antioksidan dari bercak kromatografi dengan DPPH 0,2% dalam metanol. Kemurnian  ditetapkan  secara  kromatografi  lapis tipis fase diam silika gel GF254 dan kromatografi kertas menggunakan 4 jenis fase gerak yang berbeda polaritasnya.

Uji aktivitas antioksidan penangkap radikal
Semua   isolat   yang   diperoleh   dari   hasil pemisahan secara kromatografi   (isolat A1, B2, B3, B4a  dan B4b) dilakukan uji aktivitas antioksidan penangkap radikal DPPH sesuai metode Kwon dan Kim (2003) dengan sedikit modifikasi. Larutan isolat dalam metanol pada beberapa konsentrasi (1-32 µg/mL) sebanyak 1,2 mL ditambah 0,3 mL larutan DPPH 0,5 mM dalam metanol sehingga volume  total  campuran  1,5  mL  dan  campuran dikocok kuat. Setelah didiamkan pada temperatur kamar  selama  30  menit,  sisa  DPPH  ditentukan secara  spektrofotometri  pada  panjang  gelombang 517 nm. Pengujian ini juga dilakukan pengukuran terhadap blanko (larutan DPPH yang tidak mengandung bahan uji) serta kontrol positif kuersetin.
Aktivitas   penangkap   radikal   DPPH   (%) dihitung dengan rumus:   (Ablanko-Asampel) : Ablanko  x
100 %. Data aktivitas (%) dianalisis dan dihitung nilai EC50  melalui analisis probit. EC50  adalah konsentrasi yang mampu menghambat 50% DPPH. Pengujian dilakukan dengan empat kali replikasi.

Identifikasi isolat
Isolat A1, B2, B3,   B4a  dan B4b  diidentifikasi berdasarkan  data  kromatogram. Khusus  untuk
isolat B4b identifikasi dilengkapi dengan data spektrum ultraviolet menggunakan pereaksi geser berdasarkan metode  Markham  (1988)  dan  Mabry et al. (1970), spektrum  FT-IR dalam pellet KBr dan spektrum ¹H-NMR 90 MHz dalam DMSO-d6.

Hasil Dan Pembahasan
Hasil uji aktivitas isolat sebagai antioksidan penangkap radikal
Aktivitas antioksidan penangkap radikal DPPH  masing-masing  isolat  menunjukkan bahwa isolat A1     dan B4b  mempunyai  aktivitas antioksidan penangkap radikal yang relatif lebih tinggi dibandingkan ketiga isolat yang lain (Gambar   1).   Kedua   isolat   tersebut pada konsentrasi  32  µg/mL mempunyai  aktivitas penangkap  radikal  lebih  dari  90%.  Tiga  isolat yang lain pada konsentrasi  sama menunjukkan aktivitas yang lebih rendah. Isolat   B3  dan   B4a pada konsentrasi  larutan uji 32 µg/mL bahkan belum mampu menangkap 50% radikal  DPPH.
Berdasarkan profil data yang diperoleh, maka  hanya  isolat  yang  pada  rentang  kadar
1-32  µg/mL mampu  menunjukkan  aktivitas lebih dari 50 % saja yang dihitung  nilai EC50, sedangkan   isolat   yang   pada   rentang   kadar tersebut  diatas  menunjukkan  aktivitas  kurang dari 50% tidak dilakukan ekstrapolasi. Hasil pengujian menunjukkan isolat B4b mempunyai potensi  antioksidan  penangkap  radikal  dengan

                                                     Konsentrasi isolat (µg/mL)
                                Gambar 1. Aktivitas antioksidan penangkap radikal dari isolat

EC50   6,43  µg/mL.  Aktivitas isolat  B4b   yang paling tinggi dibandingkan  keempat isolat yang lain meskipun dengan isolat A1 selisih nilai EC50 hanya   sebesar   0,42   µg/mL.   Aktivitas   anti- oksidan isolat B2   lebih rendah dibandingkan A1 dan B4b. Dua isolat yang   kurang aktif sebagai antioksidan penangkap radikal   adalah isolat B3 dan B4a. Nilai EC50  masing-masing isolat terlihat pada Tabel I.
Perbedaan aktivitas ini kemungkinan disebabkan masing-masing isolat yang diduga flavonoid tersebut mempunyai gugus hidroksi dengan   jumlah   dan   lokasi   pada   kerangka flavonoid yang berbeda. Gulcin et al. (2004) dan Pokorni   et   al.,   (2001)   menyatakan    bahwa aktivitas antioksidan dari senyawa alamiah yang berasal dari tanaman seperti flavonoid disebabkan adanya gugus hidroksi pada struktur molekulnya. Flavonoid dengan gugus hidroksi bebas  mempunyai  aktivitas  penangkap  radikal dan   adanya   gugus   hidroksi   lebih   dari   satu terutama pada cincin B akan meningkatkan aktivitas antioksidannya.

Hasil identifikasi isolat
Hasil  identifikasi  isolat  A1,  B2   dan  B3 pada kromatografi kertas memberikan data tercantum pada Tabel II. Masing-masing  isolat setelah hidrolisis menghasilkan   bercak dengan nilai hRf   yang berbeda dengan isolat awalnya. Hal  ini menunjukkan   ketiga  isolat  tersebut merupakan   O-glikosida.   Warna   biru   terang isolat A1 dibawah sinar UV 366 nm dan menjadi biru kehijauan setelah diberi uap amoniak kemungkinan   suatu  flavon, flavanon   tanpa 5-OH atau flavonol tanpa 5-OH tetapi tersubstitusi  pada  3-OH.  Warna  bercak  isolat B2  dan B3  berwarna  ungu gelap dibawah  sinar UV 366 nm dan setelah diberi uap amoniak menjadi    coklat   kemungkinan    suatu   5-OH flavon,   flavanon   atau   flavonol   (tersubstitusi pada 3OH).
Isolat B4a  dan B4b  merupakan hasil hidrolisis    karena    pada    saat    pemisahannya
dengan  kromatografi  kertas  isolat  tidak  dapat larut dalam metanol sehingga digunakan metanol-air (4 : 6) kemudian filtrat yang


Tabel I. Nilai EC50   hasil pengujian aktivitas antioksidan isolat

diperoleh  dihidrolisis. Data kromatogram isolat B4a  dan B4b tercantum pada Tabel III. Nilai hRf bercak hasil pengembangan dengan asam asetat
15% dan  BAA (4:1:5) mencerminkan bahwa kedua isolat suatu aglikon. Karakteristik bercak kromatogram kedua isolat di bawah sinar ultraviolet   menunjukkan   warna   kuning   dan setelah diuapi amoniak tidak menunjukkan perubahan  warna, kemungkinan  suatu flavonol
3-OH.
Identifikasi isolat B4b  yang menunjukkan aktivitas antioksidan paling tinggi dilanjutkan menggunakan   spektrofotometer    UV,   FT-IR dan  1H-NMR  dengan  hasil  pada  Tabel  IV, V dan VI. Berdasarkan  identifikasi  menggunakan

Tingginya aktivitas antioksidan B4b dibanding  isolat lainnya  kemungkinan    adanya gugus o-diOH dan 3-OH bebas. Hal ini  sesuai dengan Cos et al. (1998) yang menyatakan keberadaan gugus 3-OH dan 3'-OH pada cincin B dapat dihubungkan dengan aktivitas anti- oksidan penangkap radikal yang tinggi.  Adanya gugus hidroksi pada cincin B dari isolat B4b merupakan  sisi  aktif  utama  dalam memutus rantai oksidasi  dan gugus hidroksi  ganda pada cincin B lebih meningkatkan aktivitasnya.

Kesimpulan
Diperoleh  5 isolat  dari  daun  S. burahol. Semua isolat mempunyai aktivitas antioksidan penangkap  radikal  dan  B4b   merupakan  isolat paling   aktif   dengan   EC50 6,43   µg/mL. Identifikasi B4b menunjukkan 3,7,3',4'- tetrahidroksi-5-metil flavon.


Daftar Pustaka

Cos ,P., Ying, L., Calomme, M., Hu, J.P., Cimanga, K., Poel, B.V., Pieters, L., Vlietinck, A.J.,  and Berghe, D.V., 1998, Structure-Activity Relationship and Classification of Flavonoids as Inhibitors of Xanthine Oxidase and Superoxide Scavengers, J.Nat. Prod., 61 : 71-76.
Cos, P., Calomme, M., Sindambiwe,  J.B., Bruyne, T.D., Cimanga, K., Pieters, L., Vlietinck, A.J., and Berghe,  D.V.,   2001, Cytotoxicity  and Lipid Peroxidation-Inhibiting  Activity  of Flavonoids, Planta Med., 67 : 515-519.
Gulcin, I.,   Uguz, M.T., Oktay, M., Beydemir, S., and Kufrevioglu,  O.I., 2004, Evaluation  of the
Antioxidant and Antimicrobial Activities of Clary Sage (Salvia sclarea L.), Turk I. Agric. For., 28: 25-33.
Hou, W.C., Hsu, F.L. and   Lee, M.H.,  2002.,  Yam (Dioscorea batatas) Tuber Mucilage Exhibited
Antioxidant Activities in vitro, Planta Med.,  68: 1072 – 1076.
Kwon, Y.S., and Kim, C.M., 2003, Antioxidant Constituents from the Stem of Sorghum bicolor,  Arch.
Pharm.  Res.,  26 (7) : 535 – 539.
Mabry,  T.J.,  Markham,  K.R.  and  Thomas,  M.B.,  1970,  The  Systematic  Identification  of  Flavonoid,
pp. 1-343, Springe-Verlag, New  York.
Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, 1-103. terjemahan Kosasih Padmawinata, Bandung, Penerbit ITB.
Oke,  J.M.  and  Hamburger,   M.O.,  2002,  Screening  of  Some  Nigerian  Medicinal  Plants  For
Antioxidant Activity Using 2,2, Diphenyl-Picryl-Hydrazyl  Radical, AJBR, 5 : 77-79. Pokorny, J., Yanishlieva, N. and Gordon, M.,  2001, Antioxidants in Food, Practical Applications, 1-123,
Wood Publishing Limited, Cambridge, England.
Rohdiana,  D.,  2001,  Radical  Scavengers  Activity  of   Tea  Polyphenol,  Majalah  Farmasi  Indonesia,
12(1) : 53 – 58.
Sutomo,  2003,  Penurunan    asam  urat  darah  ayam  jantan  Braille  hiperurisemia  oleh  fraksi  ekstrak metanol  daun kepel (Stelechocarpus  burahol, Hook f. & Th.), Tesis, Pasca Sarjana,  Prodi Ilmu Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.



* Korespondensi :Titik Sunarni, M.Si., Apt. Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi
Jl. Letjen Sutoyo Mojosongo – SOLO,  - 57127, Telp. 0271-852518, HP:08121520941
E-mail: farmasi_usbsolo@yahoo.co.id.

SUMBER: http://mfi.farmasi.ugm.ac.id/files/news/1._18-3-2007-titik.pdf